B.1 总则
本附录规定了用培养法定性测定集中空调系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中的嗜肺军团菌，其他洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定可参照执行。
B.2 术语和定义
下列术语和定义适用于本方法。
B.2.1
嗜肺军团菌 legionella pneumophila
样品经培养在GVPC琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落。
B.3 仪器和设备
B．3.1 平皿：Φ90 mm。
B．3.2 CO2培养箱：35℃～37℃。
B．3.3 紫外灯：波长360 nm±2 nm。
B．3.4 滤膜过滤器。
B．3.5 滤膜：孔径0. 22 μm~0. 45 μm。
B．3.6 真空泵。
B．3.7 离心机。
B．3.8 涡旋振荡器。
B．3.9 普通光学显微镜、荧光显微镜。
B．3. 10 水浴箱。
B．3. 11 广口采样瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容积500 mL。
B.4 培养基和试剂
B．4,1 GVPC琼脂平板。
B．4.2 BCYE琼脂平板。
B．4.3 BCYE-CYE琼脂平板。
B．4.4 革兰氏染色液。
B．4.5 马尿酸盐生化反应管。
B．4.6 军团菌分型血清试剂。
B．5 采样
B．5.1 将广口采样瓶（B．3.11）用前灭菌。
B．5.2 每瓶中加入Na2S203溶液（c=0.1 mol/L）O.3 ml_～0.5 mL，中和样品中的氧化物。
B．5.3 水样采集位置：冷却水采样点设置在距塔壁20 cm、液面下10 cm处，冷凝水采样点设置在排水管或冷凝水盘处。
B．5.4 每个采样点依无菌操作取水样约500 mL。
B．5.5 采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15 d。
B.6 检验步骤
B．6.1 样品的沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000 r/min离心1 min去除。
B．6.2 样品的过滤：将经沉淀或离心的样品通过滤膜（B．3.5）过滤，取下滤膜置于15 mL灭菌水中，充分洗脱，备用。
B．6.3 样品的热处理：取1 mL洗脱样品，置50℃水浴（B．3.10）加热30 min。
B．6.4 样品的酸处理：取5 mL洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5 mm。
B．6.5 样品的接种：取洗脱样品（B．6.2）、热处理样品（B．6.3）及酸处理样品（B．6.4）各0. 1 mL，分别接种GVPC平板（B．4.1）。
B．6.6 样品的培养：将接种平板静置于CO2培荞箱（B．3.2）中，温度为35℃-37℃，CO：浓度为2. 5%。无CO2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10 d，注意保湿。
B．6.7 菌落观察：军团菌生长缓慢，易被其他菌掩盖，从孵育第3天开始每天在显微镜（B．3．9）上观察。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。
B．6.8 菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板（B．4.2）和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板（B．4.3），35℃～37℃培养2 d，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L一半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。
B．6.9 菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶（-／弱+），硝酸盐还原（-），尿素酶（-），明胶液化（+）．水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
